Kategori: Western Blot

Följande guide fungerar som en checklista för möjliga orsaker och lösningar med avseende på några av de vanligaste problemen från Western blot-analyserna.

Hög bakgrund

S.No. Möjlig orsak Lösning
1 För hög antikroppskoncentration
Optimera och minska antikroppskoncentrationen
2 Aggregerad sekundär antikroppsbildning
Filtrera den sekundära antikroppen genom 0,2 um filter
Använd en ny sekundär antikropp
3 För hög inkuberingstemperatur för antikroppar
Inkubera antikroppen vid 4 ° C
4 Icke-specifik sekundär antikroppsbindning eller korsreaktivitet med blockerande medel
Kör sekundär antikroppskontroll (utan den primära)
Minska den sekundära antikroppskoncentrationen
5 Korsreaktivitet mellan primär eller sekundär antikropp med blockeringsmedel
Tillsätt Tween-20 till inkubations- och tvättbufferten
6 Oförenligt blockerande medel
Jämför olika blockerande buffertar
7 Ofullständig blockering
Optimera valet av blockeringsbuffert
Öka proteinkoncentrationen i blockeringsmedel
Optimera blockeringstid och / eller temperatur; Blockera i 2 timmar vid normal temperatur eller över natten vid 4 ° C
Tillsätt 0,05% Tween 20-tvättmedel i blockeringsmedel
Tillsätt 0,05% Tween 20-detergent i lösning av antikroppspädningsmedel
8 Otillräcklig blockering
Förläng blockeringstiden eller använd ett kompatibelt blockeringsmedel (t.ex. skummjölk, BSA, serum, etc.)
9 Korsreaktivitet av antikropp med andra proteiner
Använd olika blockeringsmedel (Använd inte skummjölk med biotinsystem
Minska den sekundära antikroppskoncentrationen
Testa korsreaktivitet mellan sekundär antikropp och membran
10 Otillräcklig tvätt
Öka antalet tvättar och buffertvolym
Tillsätt 0,05% Tween 20-tvättmedel i tvättbuffert
11 För lång exponeringstid
Minska exponeringstiden
12 Membranproblem
Använd ren pincett; Använd handskar
Använd nya membran
Se till att vätskan är tillräcklig för att hålla membranet fuktigt
Använd avfärgningstabell vid inkubation
Undvik överlappande membran
Hantera försiktigt och undvik att skada membranet
13 Otillräcklig membran tvätt
Öka antalet tvätt
14 Oförenligt membran
Nitrocellulosamembranets bakgrund är lägre än för PVDF-membranet
15 Torrt membran
Se till att membranet är täckt med en tillräcklig mängd vätska och förhindra att det torkar
16 Förorenad buffert
Använd ny buffert eller filterbuffert före användning
17 Förorenad utrustning
Se till att all utrustning och verktyg är rena och att ingen gel är kvar på membranet
Svagt / inget signal

S.No. Möjlig orsak Lösning
1 Felaktig proteinöverföring till membran
Fläckgel efter överföringen är klar för att bestämma överföringen är effektiv
Använd Ponceau S för att färga membranet för att bestämma överföringen är effektiv
Säkerställ tillräcklig kontakt mellan gel och membran under överföring
Se till att överföringssmörgåsen är korrekt monterad
Våt membran enligt instruktionen
Undvik överhettning under elektroöverföring
Använd markörer för positiv kontroll eller molekylvikt
Optimera överföringstid och ström
Använd Boster’s membranöverförande buffert (AR1149)
Undvik att förstöra prov (antigenbestämningsmedel) vid hantering
2 Otillräcklig protein- och membranbindning
Tillsätt 20% metanol för att överföra buffert
Använd småhålsmembran
3 Otillräcklig antikropp
Öka antikroppskoncentrationen
4 Otillräckligt antigen
Ladda mer protein
5 Antigenmaskning genom att blockera buffert
Jämför olika blockerande buffertar
Optimera proteinkoncentrationen av blockeringsmedel
Minska blockeringstiden
6 Närvaro av natriumazid i buffertar
Eliminera natriumazid från buffertar
7 För kort exponeringstid
Förläng filmens exponeringstid
8 För kort underlagsinkubationstid
Förläng underlagets inkubationstid till fem minuter
9 Prövning av protein på membranet
Optimera mängden blockerande medel
10 Nedbrytning av protein under lagring
Förbered proteinprovet på nytt
11 Oförenliga primära och sekundära antikroppar
Se till att primär antikropp, sekundär antikropp, substrat, enzymsystem och prover är kompatibla
Använd lastkontroll för att testa effektiviteten hos det andra detekteringssystemet
12 Låg koncentration av primär antikropp och / eller sekundär antikropp
Öka antikroppskoncentrationen
Öka inkubationstiden
13 Korsreaktivitet mellan blockeringsmedel och antikroppar (primär eller sekundär)
Använd milt tvättmedel som Tween20
Byt blockeringsmedel (vanligtvis används mjölk, BSA, serum eller gelatin)
14 Oförmåga hos primär antikropp att känna igen proteinet i testat prov
Kontrollera instruktionen
Använd positiv kontroll
15 Lågt eller inget innehåll av målprotein (ineffektivt antigen)
Använd positiv kontroll
Öka mängden belastning till 20-30 ug protein per brunn
Använd proteasinhibitor eller fraktionellt målprotein
16 Otillräcklig överföring och överdriven tvätt
Kontrollera överföringen med Ponceau S
Blötlägg PVDF-membran i metanol
Undvik överdriven tvätt
17 Over-blockerande
Använd 0,05% skummjölk eller ingen mjölkutspädningsbuffert
Byt blockerare
Minska blockeringstiden
18 Förlust av primär antikroppseffektivitet
Förbered färsk antikropp och förvara ordentligt när den inte används
Undvik upprepad frysning och upptining
19 Hämning av sekundär antikropp med natriumazid
Undvik att använda natriumazid tillsammans med HRP-konjugerade antikroppar
20 Förlust av effektivitet i enzymkonjugat och substrat
Blanda enzymkonjugat och substrat (ingen färgutveckling när enzymet är inaktivt)
Använd aktiverat enzymkonjugat och färskt underlag
21 Felaktig våtöverföring för membran
Blötlägg PVDF-membranet i 100% metanol
22 Otillräcklig molekylvikt av målprotein (<10 kDa)
Använd småhålsmembran
Minska överföringstiden
23 Likhet eller närhet i värden mellan målproteins isoelektriska punkt och överföringsbuffertens pH-värde
Prova andra buffertar som CAPS-buffert (pH 10,5)
Prova buffertar med lågt pH-värde, t.ex. ättiksyrabuffert
24 För hög metanolkoncentration
Minska metanolkoncentrationen eller använd isopropylalkohol