RISA Technique – RISA analysis of ribosomal inter-gene sequences

Vad är RISA-metoden?

RISA-metoden, alltså analys av ribosomala intergeniska sekvenser, används för att analysera olika typer av mikroorganismer. Den används för att jämföra bakteriekulturer som skiljer sig åt beroende på vilken typ av miljö de lever i eller vilken behandling som använts. Det är en odlingsoberoende metod och är även känd som community fingerprinting.

Processens förlopp:

RISA-tekniken bygger på PCR-amplifiering av rRNA-genens operonregion som finns mellan den lilla (16S) och stora (23S) ribosomala subenheten. Detta kallas det intergeniska spacer-området (ISR). Genom att använda oligonukleotidprimers riktade mot konservativa områden i 16S och 23S kan RISA-fragment genereras från de flesta dominerande bakteriella gener i ett miljöprov.

Till skillnad från majoriteten av rRNA-operonet, som har en strukturell funktion, kan delar av RISA koda för tRNA beroende på bakterieart. Den taxonomiska värdet av ISR bygger dock på dess stora heterogenitet både i längd och nukleotidsekvens.

I RISA-metoden utnyttjar vi variationen i ISR-längd, som visat sig ligga mellan 150 och 1500 baspar. Produkten från PCR är en blandning av fragment från flera dominerande individer av en given art. Produkten separeras sedan med polyakrylamidgel-elektrofores och DNA visualiseras efter färgning.

Resultatet av elektroforesen är ett komplext mönster av band som ger en art-specifik profil där varje DNA-band motsvarar en viss bakteriepopulation.

Vad är fingeravtrycksteknik?

Fingeravtrycksteknik är en laboratorieteknik som används för att fastställa sannolikheten att en persons identitet baserat på nukleotidsekvenser i vissa regioner av mänskligt DNA, vilka är unika för varje individ. DNA-prov tas i olika sammanhang, såsom brottsutredningar, andra kriminaltekniska ändamål och faderskapstester. I sådana situationer strävar man efter att matcha två DNA-prov.

Användningen av fingerprint-tekniker möjliggör bedömning av skillnader mellan mikroorganismpopulationer, men ger inte direkt taxonomisk klassificering.

Vad kan vi identifiera med RISA-metoden?

Med RISA-metoden kan vi identifiera bakterien Enterococcus cecorum. Den tillhör opportunistiska patogener och kan spela en roll som etiologisk faktor vid sjukdomar hos människor (främst sjukhusinfektioner), kycklingar och duvor. På senare tid verkar denna bakterie vara ett hot mot fjäderfäindustrin över hela världen. Infektion med denna bakterie hos kycklingar kan orsaka sepsis, endokardit eller i allvarliga fall hjärnnekros och encefalomalaci.

Denna bakterie angriper sällan människokroppen, men fall av infektion i postoperativt bråcksår och kolonisering i urinvägarna har förekommit.

Källor

https://en.wikipedia.org/wiki/Ribosomal_intergenic_spacer_analysis
https://www.eeescience.utoledo.edu/faculty/sigler/Von_Sigler/LEPR_Protocols_files/RISA.pdf
https://www.vetpol.org.pl/dmdocuments/ZW_2012_07_08.pdf
https://archiwum.inig.pl/INST/nafta-gaz/nafta-gaz/Nafta-Gaz-2013-11-04.pdf
https://www.genome.gov/genetics-glossary/DNA-Fingerprinting
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2052297515000517
https://bmcvetres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-016-0761-1
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30339512/